Nghiên cứu tách chiết Chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ sinh học
1. Mở đầu

Trong xương sụn động vật, đặc biệt là sụn của các loài cá biển như cá mập, cá nhám, hàm lượng chondroitin sulfate (CS) là khá cao. CS là một glycosaminoglycan (GAG) được tìm thấy trong tự nhiên như một polime mạch thẳng (không phân nhánh) gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 phân tử đường N-acetyl-D-galactosamin và D-glucuronic acid xen kẽ nhau, các gốc đường này được sulfat hoá hay không bị sulfat hoá. Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG), là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharid. CS có vai trò bảo vệ sụn khớp, góp phần nuôi dưỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái tạo lớp giác mạc, ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu như từ da cá Labeo rohita, sụn cá mực, cá mập, sụn gà, sụn bò. Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhằm hạ giá thành sản phẩm. Tại Việt Nam, hiện nay chưa có nhóm nghiên cứu nào điều tra nghiên cứu thu nhận CS từ các nguồn xương sụn cá phế thải trong các nhà máy chế biến hải sản.

Mục đích của nghiên cứu này là điều tra khả năng thu nhận CS từ xương sụn cá đuối, cá nhám sống tại các vùng biển Việt Nam bằng công nghệ sinh học. Việc sử dụng enzym thay thế các chất hóa học là rất cần thiết vì giảm độ độc hại trong khi sản xuất cũng như tăng chất lượng của chế phẩm CS do các axid hay xút thường cắt các mạch CS thành các glucose.

2. Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu: Xương sụn cá đuối (Dasyatis Kuhlii), cá nhám (Carcharhinus Sorrah) được thu thập từ vùng biển Hải Phòng.

Hoá chất, thiết bị thí nghiệm: Các hóa chất phân tích đều đạt độ tinh khiết cao của các hãng Sigma, Invitrogen, Merk, Prolabo, Bio-Canada: casein, folin, albumin huyết thanh bò (BSA), glucose,tyrosine, 1,9-dimethylmethylene blue...

Xác định hoạt độ protease: bằng khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất của Leluk và cộng sự và theo phương pháp Anson cải tiến.

Xác định hàm lượng protein: theo phương pháp Lowry.

Phương pháp sinh học tách chiết chondroitin sunfate:

- Chuẩn bị mẫu: Xương sụn cá nghiền nhỏ, 10g xương sụn thêm vào 40 ml nước khử ion, 1ml azid natri (0,02%).
- Sử dụng phương pháp thủy phân xương sụn cá đuối, cá nhám theo Garnjanagoonchorn và cộng sự.

Định tính và định lượng CS bằng 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB): Xác định CS của dung dịch theo Farndale và cộng sự.

Xác định pH tối ưu: Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay đổi pH của đệm (đệm Na-acetat (0,01 M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01 M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5). Mẫu đối chứng làm như mẫu thí nghiệm nhưng bất hoạt enzym bằng đun sôi ở 100oC trong 30 phút.

Xác định nhiệt độ thủy phân tối ưu: Với cùng một điều kiện giống nhau, pH tối ưu được xác định, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản ứng thủy phân từ 30-80oC. Xác định thời gian thủy phân tối ưu: Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH và nhiệt độ) và cùng 1 nồng độ enzym, tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (1giờ, 4giờ, 8giờ, 12giờ, 16 gìơ, 18giờ).

Xác định nồng độ enzym thủy phân tối ưu: Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định, tiến hành phản ứng ở các nồng độ enzym khác nhau (0,1 ml; 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml enzym protease của VSV/1g xương sụn cá).

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Xác định hàm lượng CS trong xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah)

Hàm lượng CS trong các mẫu xương sụn cá

- Mẫu xương sụn Cá đuối (Dasyatis kuhlii): 12,04 ± 1,54 % CS/1g sụn khô, 6,02 ± 0,77 % CS/1g sụn tươi.
- Mẫu xương sụn Cá nhám (Carcharhinus sorrah): 17,2 ± 1,53 % CS/1g sụn khô, 8,6 ± 0,76 % CS/1g sụn tươi.

Do CS liên kết protein và là thành phần cấu tạo trong xương sụn, nên xương sụn cá cần phải thủy phân mới có thể xác định được hàm lượng CS. Chúng tôi đã sử dụng papain để thủy phân xương sụn cá đuối, cá nhám theo Garnjanagoonchorn và cộng sự và phương pháp DMMB để xác định hàm lượng CS. Kết quả cho thấy hàm lượng CS trong xương sụn cá nhám (Carcharhinus Sorrah) cao hơn trong xương sụn cá đuối (Dasyatis Kuhlii). Hàm lượng CS trong cá đuối (Dasyatis Kuhlii) ở Việt Nam cũng gần tương đương với hàm lượng CS trong cá đuối (Dasyatis zugei) ở Thái Lan được Garnjanagoonchorn và cộng sự khảo sát. Garnjanagoonchorn cũng xác định hàm lượng CS trong sụn vi cá mập là khoảng 9,6 %. Như vậy nguyên liệu xương sụn cá đuối và cá nhám từ các nhà máy chế biến Hải sản Việt Nam có hàm lượng CS khá cao, đây là cơ sở để tiến hành nghiên cứu, khai thác nguồn dược liệu quý chondroitin sulfate.

3.2. Sàng lọc protease ngoại bào có hoạt tính cao từ vi sinh vật

Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã sử dụng enzym papain hoặc các protease từ vi sinh vật để thủy phân protein liên kết với CS trong xương, sụn cá, gà, bò... Tuy nhiên nếu sử dụng papain thì giá thành rất cao và nguồn enzym từ papain là khan hiếm. Vì vậy để có thể chủ động cung cấp nguồn enzym từ vi sinh vật và giảm giá thành hơn nữa trong quá trình tách chiết CS, nhóm nghiên cứu tiến hành sàng lọc các protease từ vi sinh vật có khả năng thủy phân protein gắn kết với CS trong xương, sụn cá.

Từ 11 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym protease ngoại bào đã được Viện Công nghệ Sinh học và trường Đại học Khoa học Tự nhiên khảo sát, chúng tôi tiến hành sàng lọc để tìm các chủng có khả năng sinh enzym protease ngoại bào mạnh nhất. Vi khuẩn được nuôi trong các môi trường đặc trưng của chúng và bổ sung cơ chất cao thịt với mục đích làm tăng khả năng tiết enzym protease như đã mô tả trong phần phương pháp. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã sử dụng casein làm cơ chất để sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzym protease ngoại bào. Qua kết quả thí nghiệm thu được 5 chủng vi khuẩn Bio1, Bio 2, Bio 7, B26, MF 34 có hoạt tính enzym protease mạnh hơn các chủng khác, trong đó chủng B26 thuộc chi Baccillus đã được định tên.

Hoạt tính protease của dịch nuôi 5 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease mạnh được chúng tôi xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất casein 1%.

Thể tích dịch nuôi vi sinh vật cho vào mỗi giếng là: 150µl; đối chứng dương là dung dịch enzym tripsin 1mg/ml (50µl). 1, 4, 7: Đối chứng dương; 2: Bio 7; 3: B26; 5: Bio 1; 6: Bio2; 8: MF34 .

Kết quả cho thấy các chủng B26, Bio2 và MF34 có hoạt tính protease mạnh hơn. Kết quả định lượng hoạt độ của enzym protease từ cả hai phương pháp Anson cải tiến và phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất casein 1% hoàn toàn phù hợp với nhau.

3.3. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease trên cơ chất xương sụn cá đuối, cá nhám

Khả năng hoạt động của enzym protease còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, thời gian tối thích cho phản ứng v.v. Nhóm nghiên cứu lựa chọn 3 chủng B26, MF34 và Bio 2 là 3 chủng sinh protease mạnh nhất để tối ưu hóa các điều kiện cho enzym hoạt động tối ưu nhất trên cơ chất xương sụn cá.

Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease, phản ứng enzym được thực hiện ở cùng một thời gian, nhiệt độ 40oC trong đệm Na-acetat (pH: 4,5; 5,5) và đệm phosphate (pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5). Kết quả cho thấy enzym protease ngoại bào của chủng B26, MF34 có hoạt tính cao nhất tại pH 8,5 và của chủng Bio 2 có hoạt tính cao nhất tại pH 7,5. Như vậy enzym protease ngoại bào của 3 chủng trên hoạt động mạnh trong vùng pH kiềm yếu. Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym. Chúng tôi sử dụng pH tối thích để nghiên cứu ở trên cho phản ứng của từng enzym và thay đổi nhiệt độ của phản ứng enzym từ 30-80oC. Kết quả cho thấy protease của 2 chủng B26 và MF 34 đều tối ưu ở nhiệt độ 50oC, protease của chủng Bio-2 tối ưu ở 40oC.

Sau khi tìm được pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym, chúng tôi so sánh khả năng thủy phân protein liên kết CS trong xương sụn cá của protease 2 chủng B26 và MF34. Kết quả thấy chỉ sau 2h các protease đã thủy phân xương sụn cá rất tốt. Hiệu quả thủy phân xương, sụn cá đuối, cá nhám của protease ngoại bào từ chủng B26 và MF34 cũng dễ dàng nhận ra bằng cảm quan (Hình 4). Điều này cho thấy khả năng ứng dụng của protease từ chủng B26 và MF34 thay thế enzym papain thương mại cho quá trình tinh sạch CS là rất khả thi.

3.4. Nghiên cứu điều kiện thủy phân protein liên kết CS trong xương sụn cá của protease ngoại bào từ chủng B26

Từ các kết quả thăm dò và so sánh khả năng thủy phân xương sụn cá của protease ngoại bào từ chủng B26 và MF34 ở trên, chúng tôi lựa chọn protease ngoại bào của chủng B26 để tối ưu hóa khả năng thủy phân xương sụn cá.

Kết quả cho thấy hoạt tính thủy phân xương sụn cá của protease ngoại bào từ chủng B26 cao nhất với thời gian thuỷ phân là 12 giờ (100%) với tỷ lệ 0,4ml enzym (0,17UI/ml) cho 1 gam sụn trong các điều kiện pH ( 8,5) và nhiệt độ tối ưu ( 50oC ).

4. Kết luận

1. Hàm lượng CS trong xương sụn cá nhám (Carcharhinus Sorrah) đạt khoảng 8,6 %, hàm lượng CS có trong xương sụn cá đuối (Dasyatis Kuhlii) đạt khoảng 6,02 %. Đây là lần đầu tiên hàm lượng CS trong xương sụn cá nhám và cá đuối của Việt Nam được khảo sát.

2. Từ 11 chủng giống vi khuẩn có khả năng sinh enzym protease ngoại bào đã tuyển chọn được 3 chủng sinh protease có hoạt tính cao là B26, Bio 2 và MF34.

3. Xác định được pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các protease từ 3 chủng B26, Bio-2, MF34 trên cơ chất xương sụn cá đuối, cá nhám. Enzym protease của chủng B26 và MF 34 có hoạt tính cao nhất tại pH 8,5, của chủng Bio 2 tại pH 7,5. Enzym protease của chủng B26, MF34 có hoạt tính cao nhất ở 50oC ; của chủng Bio 2 ở 40oC. Trong đó chủng Bacillus subtilis VTCC-B-26 có khả năng thủy phân protein liên kết CS trong xương sụn cá mạnh nhất.

4. Xác định được các điều kiện thuỷ phân tối ưu của enzym protease ngoại bào từ chủng B26 trên cơ chất xương sụn cá, tỷ lệ 0,4 ml (0,17 UI/ml) enzym/1g sụn cá và thời gian thủy phân là 12giờ.

Nguồn: Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị Lan Oanh. 2010. Nghiên cứu tách chiết Chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ sinh học. Bản tin Quý Số 16 -Tháng 4/2010. Viện Nghiên cứu Hải sản. Ảnh: www.qrbiz.com.